H&E Stain

H&E 염색방법은 가장 일반적인(Routine) 염색법으로 병리조직표본이나 표본 전체를 개괄적으로 확인할 수 있는 염색 방법입니다. 사용되는 용액으로는 헤마톡실린(Hematoxylin)과 에오신(Eosin)이 사용이 됩니다.

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헤마톡실린은 세포의 핵, 특히 핵 내의 염색질과 핵막을 염색하며, 핵의 핵질(nucleoplasm)은 염색되지 않은 채로 남기 때문에 염색질의 염색 패턴을 쉽게 확인할 수 있습니다.

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에오신은 H&E 염색에서 대조염색제로 사용이 되면 헤마톡실린에 염색되지 않는 거의 모든 구조에 붉은색으로 염색이 됩니다.

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<<H&E Staining의 원리(Principle>>

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Hematoxylin이 산화제(mercuric oxide)에 의해 hematein이 생성.

(산화제: 공기, sodium iodate, mercuric oxide)

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hematein + Aluminum(매염제) -> alum-hematein lake(가염상태)  형성

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이 lake는 등 전점 pH2.9에서 양(+) 이온을 띠며 + 음(-) 이온으로 하전되는 DNA의 인산기와 결합하여 청색화 (Bluing) 됩니다.

반대로, 산성염료인 eosin은 등전점 pH.5.8에서 음(-) 이온을 세포질 내의 백질은 양(+) 이온으로 파전되어 이온결합을 하여 분홍색으로 염색됩니다.

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헤마토실린(Hematoxylin)은 피나무의 심재에서 추출하는 염료는 hematoxylin, hematein 등의 혼합물로, hematein은 hematoxylin의 산화로 만들어집니다. hematein은 색깔을 띠고 있지만 잘 달라붙지 않으며, hematoxylin은 염기성 염료로 분류됩니다.

조직에서 인산기가 많이 들어 있는 세포 핵(DNA와 RNA는 당과 인산으로 구성되어 있기 때문에), 염색체, 미토콘드리아 등을 청자 색으로 염색합니다.

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에오신(Eosin)은 fluoresceion의 유도체로 산성 염료이기 때문에 염기성을 띠는 원자단과 결합하여 색깔을 내며 염기성을 띠는 원자단으로서 세포의 안 팎에 널리 분포하고 있는 단백질 아미노기를 염색 시킵니다. 염색한 후 세포질이나 세포 바깥 구조를 대비시키기 위해 에오신으로 대조 염색을 합니다.

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<<H&E stain protocol>>

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① 탈파라핀(Deparaffin):   Xylene에 넣고 5분, 3번  dipping

현미경 관찰을 위해서는 염색을 해야 하는데 염색약은 대부분 수용성 성질을 지니고 있어 소수성인 파라핀을 제거하는 과정입니다.

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② Xyxlene 제거 및 함수:   100% EtoH -> 50% EtoH 순서로 각 단계마다 5분 dipping

자일렌을 제거하기 위해서 알코올로 제거하는 과정입니다.

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③ 헤마톡실린 염색(Hematoxylin stain):   (Hematoxylin 용액에 1분 40초 dipping

조직 속의 여러 가지 물질들의 성질에 따라 핵을 염색하는 과정입니다.

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④ 감별 탈색(Differentiator):    (0.3% Hcl-Alcohol로 1~2회 dipping)

0.3% Hcl-Alcohol로 1-2회 dipping 후 바로 흐르는 물에 수세한다.

오래 있을 경우 색이 빠져 감별할 수 없다.

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⑤ 중화 현색(Blueing):   0.3% Ammonia Water 2-3회 dipping

0.3% Ammonia Water로 dipping 후 흐르는 물로 수세한다. Ammonia Water 대처 용액으로는 Scott tap water sk 1% lithium carnonate 용액을 사용하기도 한다.

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⑥ 에오신 염색(Eosin stain):  Eosin 용액에 10~20 sec dipping

대조염색으로 사용하며, 헤마톡실린에 염색되지 않는 거의 모든 구조, 세포질을 염색합니다.

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⑦ 탈수(Dehydration):    50% EtoH-> 100% EtoH 순서로 각 단계마다 3회 dipping

물을 제거하기 위해서 알코올로 제거하는 과정입니다.

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⑧ 투명(Clearing):   Xylene에 넣고 3분, 3번 dipping

탈수를 하기 위해 사용했던 알코올을 제거하는 과정이며, 봉입액과 물이 섞이면 뿌옇게 보일 수 있다.

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⑨ 봉입(Mounting)

염색이 완료된 조직을 봉입제와 cover glass를 사용해 조직 표본으로, 정밀한 검사, 염색 퇴색 방지, 조직절편의 부패 방지, 물리적 손상을 막기 위한 과정입니다.

 

 

출처:

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